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易错PCR（Error-Prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3'→5'校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。很多时候，用户需要通过易错PCR得到不同突变数的DNA片段。为满足此需求，本公司开发是了可调易错PCR试剂盒。在实用过程中，发现易错PCR循环数很难优化，PCR循环数过多或过少都得不到清晰的DNA条带用于后续回收和克隆。本公司继续改进并推出染料法实时可调易错PCR试剂盒。

• 即开即用，十分简单方便。
  
• 在荧光信号进入平台期即可终止循环，此时电泳就可以得到清晰的突变DNA条带，不需要盲目摸索，节约大量的时间。
  
• 实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2～8个突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
  
• 可用于连续易错PCR，只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
  
• 可以扩增的DNA片段更长，达到2kb，对于2kb以上的产物，建议分段扩增。
  
• 本试剂盒足够100次30μL体系的染料法实时易错PCR。
  
• 本制品只能用于科研。

• 将引物稀释到10μM。引物也是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25～30nt之间，GC含量在45%～60%之间，3'端GC含量低，并且没有发夹结构。
• 用自备易错PCR引物和自备的常规PCR试剂扩增制备易错DNA模板（常规PCR产物），胶回收并准确确定浓度。
  
  • 易错PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物，因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错PCR引物扩增所得，在易错PCR扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。
• 将回收的DNA片段（模板）稀释到1ng/μL、10ng/μL和100ng/μL三个浓度。
  
  • 模板使用量是影响突变率的最重要因素，模板DNA为非突变DNA，扩增产生的DNA为突变DNA，易错PCR体系最终DNA量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，则突变DNA在终产物中的相对比例就越低，突变率就越低。故建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
• 根据每1000bp的预期突变数按下表确定30μL易错PCR体系中MnCl2和dGTP的用量（这是在模板DNA不超过1ng的前提下的数据）。表中的Mn表示可调易错PCR专用的MnCl2，dG表示可调易错PCR专用的dGTP：
  

  预期突变数	2个	3个	4个	5个	6个	7个	8个
  Mn用量(μL)	0	1.0	2.5	4.0	4.0	4.0	4.0
  dG用量(μL)	0	0	0	1.0	2.0	3.0	4.0

• 设置30μL体系的可调易错PCR：第一次建议设置3个模板浓度。在3干净的PCR管中，分别加入下列成分。最后加可调易错PCR专用MnCl2：
  

  成分	模板用量1	模板用量2	模板用量3
  5×染料法实时可调易错PCR Mix	6μL
  可调易错PCR专用dGTP	根据上步用量表表选择
  自备DNA模板	1μL(1ng/μL)	1μL(10ng/μL)	1μL(100ng/μL)
  自备PCR引物(10μM each)	1μL each
  可调易错PCR专用Taq DNA聚合酶	0.5μL
  可调易错PCR专用MnCl2	根据上步用量表表选择
  自备超纯水	至30μL

• 按已经优化的常规PCR条件进行染料法实时易错PCR：
  

  步骤	参数
  PCR前变性	94℃ 3分钟
  易错PCR(60次循环，但操作时PCR应该在荧光信号进入平台期后结束，不一定要做满60个循环)	94℃ 1分钟
  	60℃ 1分钟
  	72℃ 3～10分钟。在此步采集SYBR通道的荧光

  • 由于易错PCR含高浓度的镁离子，因此容易形成引物二聚体，因此需要使用60℃这种较高的复性温度，以避免小片段扩增产物竞争性抑制PCR。
    
  • 易错PCR一般不需要热启动，也不需要在易错PCR结束后做延伸处理。
    
  • 易错PCR循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变DNA（原始模板）的比例就越高。
    
  • 在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多。
    
  • 循环数过多或过少都不容易在电泳时形成清晰的DNA条带，没有条带就没法回收克隆。所以需要在荧光信号进入平台期后立即停止PCR。
• 染料法实时易错PCR结束后，取3μL电泳检查。
  
• 如果有预期大小的PCR产物，则用剩余的PCR产物进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。
  
• 如果需要提高突变率，可以选择上轮易错PCR产物为模板，再进行下一轮易错PCR。
  
• 如果迪一轮易错PCR没有得到预期大小的PCR产物或者扩增60次也没有荧光信号，可以按下列操作追加进行一轮追加PCR。
  
• 在PCR管中，加入3μL 10×可调易错PCR专用追加dNTP到27μL电泳剩下的第一轮易错PCR体系中（用了3μL去电泳），按下表进行追加PCR（chasing PCR）。
  

  步骤	参数	循环数
  追加PCR	94℃ 1分钟	循环20次，但实际操作时，只要荧光信号进入平台期即可在72℃结束时终止PCR。
  	60℃ 1分钟
  	72℃ 1分钟，在此步采集SYBR通道的荧光。

  • 追加PCR只做20次循环。
• 追加PCR结束后，再电泳检测。如果有条带，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以此轮追加PCR的产物为模板，再进行下一轮易错PCR。
  
• 如果没有预期大小的PCR产物，则需要分析原因。